昭衍生物
一、概述
1986年美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準了首個單抗藥物。30多年來，抗體藥物領域的發(fā)展日新月異，到目前為止，F(xiàn)DA共批準了近百個治療性抗體藥物，主要用于治療癌癥、自身免疫性疾病、傳染病等多種疾病。在2021年全球藥品銷售TOP10排行榜上[1]，抗體類藥物占5種，其全球銷售總額接近700億美元，治療性抗體已經(jīng)成為目前制藥行業(yè)增長最快，盈利最大的產(chǎn)品之一。
二、抗體抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的基本機理
圖1. 抗體揮發(fā)作用的方式[2]
抗體抗腫瘤藥物的銷售市場廣闊。據(jù)最新藥品銷售數(shù)據(jù)，2021年銷售額排第一的K藥（Keytruda）銷售額達到171.8億美元，近年來，Keytruda的適應癥仍不斷擴大，目前在全球獲批的適應癥超30項，包括黑色素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、結直腸癌、宮頸癌等；排第二的O藥（Opdivo）則是全球首個獲批的PD-1抑制劑。自2014年7月獲批以來，Opdivo已在60多個國家和地區(qū)獲批治療10余個癌種，涵蓋肺癌、頭頸癌、胃癌、食管癌、肝癌、腎癌、結直腸癌等。2021年TOP 10腫瘤單抗藥的全球銷售總額超過430億美元，其中1997年上市的利妥昔單抗，銷售額仍達到27.7美金，可見抗體抗腫瘤藥物的巨大市場和強大的生命力。2021年腫瘤單抗藥全球銷售額TOP 10榜單見下圖：
表1. 2021年全球TOP10抗腫瘤單抗銷售額
根據(jù)國內(nèi)2021年抗腫瘤市場前三季度藥品銷售數(shù)據(jù)，在TOP 10產(chǎn)品中，包含4款生物藥，這四款單抗產(chǎn)品分別為貝伐珠單抗、曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗[3]。其中曲妥珠單抗從基礎到臨床的諸多研究均已充分證實ADCC效應是其重要作用機制，巖藻糖敲除的曲妥珠單抗在體外活性和體內(nèi)藥效學評價上都具有明顯的優(yōu)勢，有望在不久的將來取代曲妥珠單抗[4]。
目前，2種無巖藻糖修飾的單克隆抗體已被FDA批準用于癌癥治療。[9]
圖2. 巖藻糖與ADCC活性關系示意圖[14]
四、去巖藻糖化的成功案例
日本麒麟制藥公司利用同源重組技術對CHO細胞中的α-1,6巖藻糖轉移酶（FUT8）進行基因干擾，得到了三株能夠用于工業(yè)生產(chǎn)完全無巖藻糖抗體的CHO細胞株，其表達的抗CD20抗體相對于野生型抗體來說，ADCC效應提高100多倍。
2012年3月，日本麒麟制藥公司的Mogamulizumab在日本批準上市，這是第一個上市的糖蛋白工程抗體，在治療性抗體領域具有里程碑的意義。Mogamulizumab是靶向CC趨化因子受體4（CCR4）的人源化單克隆抗體（mAb），而CCR4經(jīng)常表達于包括皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL）在內(nèi)的某些血液惡性腫瘤細胞。協(xié)和麒麟通過降低mogamulizumab的糖鏈結構中的巖藻糖成分，增強了ADCC效應，對惡性血液疾病進行治療。2020年，Mogamulizumab的全球銷售額仍達到1.26億美元。
第二個被FDA批準上市的無巖藻糖修飾的單克隆抗體是羅氏的obinutuzumab，這是第二代anti-CD20單抗，在抗體制備的過程中過表達N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶3和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ，去除了50%的鹽藻糖修飾，從而降低抗體巖藻糖的含量，進而增強ADCC效應。與第一代產(chǎn)品利妥昔單抗相比，第二代產(chǎn)品obinutuzumab對人FcγRIII的親和力較第一代高50倍，其對表達CD20的淋巴瘤細胞系的ADCC效應增加了10-100倍，在臨床上也體現(xiàn)了治療的優(yōu)越性。2020年，obinutuzumab全球銷售額約7.24億美元。
五、昭衍生物平臺優(yōu)勢
昭衍生物在自主知識產(chǎn)權的CHO-K1基礎上進行巖藻糖敲除，獲得了完全無巖藻糖的宿主細胞，通過抗體表征及功能驗證，得到了完全無巖藻糖的可應用于工業(yè)生產(chǎn)的細胞株CHO-K1-TGZ。
抗體表達驗證：利用3個不同靶點轉染CHO-K1-TGZ進行抗體表達及功能測試（圖3），通過minipool轉染及篩選，補料流加培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)14天后細胞活率仍大于90%，平均產(chǎn)量為3.88g/L。
抗體親和力測定：利用Biacore檢測抗體與抗原FcγRIIIa親和力，結果見圖4，通過結合和解離曲線顯示，去巖藻糖基化的宿主細胞（CHO-K1-TGZ）表達的抗體較野生型CHO細胞（CHO-K1）表達的抗體與FcγRIIIa結合的親和力提高了約6倍。
圖4. 表達抗體與FcγRIIIa (V176)親和力測定
抗體ADCC活性驗證：ADCC檢測由去巖藻糖基化的宿主細胞（CHO-K1-TGZ）表達的抗體（SF4）和野生型CHO細胞（CHO-K1）表達的抗體（對照）對靶細胞的ADCC效應進行比較， 結果顯示由去巖藻糖基化的宿主細胞表達的抗體相對于野生型CHO細胞表達的抗體介導的NK細胞對靶細胞的殺傷具有明顯提高，其ADCC EC50值提高了約43倍（圖5）。
圖5. 表達抗體ADCC活性測定
抗體糖型鑒定：所得抗體經(jīng)PNGase F處理，獲得游離的N-糖鏈；2-AB衍生標記后經(jīng)親水作用色譜分離-熒光和質譜檢測（HILIC-FLR-MS/MS），圖6所示，通過去巖藻糖基化的宿主細胞（CHO-K1-TGZ）表達的抗體未發(fā)現(xiàn)含有巖藻糖的N-糖鏈，巖藻糖被完全敲除；此外主要糖型皆為常見的IgG糖型：G0、G1、G2，不含免疫厡性的糖型、復雜糖型以及高甘露糖糖型。
圖6. 表達抗體糖型鑒定
隨著抗體類藥物在市場上占有舉足輕重的地位，細胞工程研究也有了更加廣泛的應用。日本已經(jīng)上市了無巖藻糖抗體，并且有越來越多的無巖藻糖抗體應用于臨床研究中。因此，構建可以產(chǎn)生此抗體的細胞株具有很高的實用價值。昭衍生物擁有自主知識產(chǎn)權的巖藻糖敲除宿主細胞株（CHO-K1-TGZ），已成功應用于抗體藥物生產(chǎn)，使抗體藥效得以大幅提升。
參考資料：
1，藥渡數(shù)據(jù)庫.
2，Nitin Agarwal etal; N-Glycosylation of IgG and IgG-Like Recombinant Therapeutic Proteins: Why Is It Important and How Can We Control It? ; Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 2020. 11:13.1-13.28.
3，藥融云數(shù)據(jù);最高漲237% | 抗腫瘤藥銷售Top10公布（附名單）.
4，Lewis, G. D. et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 37, 255-263 (1993).
5，Musolino, A. et al. Immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms and clinical efficacy of trastuzumab-based therapy in patients with HER-2/neu-positive metastatic breast cancer. J Clin Oncol 26, 1789-1796, doi:10.1200/JCO.8957 (2008).
6，Cartron, G. et al. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood 99, 754-758 (2002).
7，Weng, W. K. & Levy, R. Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol 21, 3940-3947, doi:10.1200/JCO.2003.013 (2003).
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9，Shinkawa, T. et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of biological chemistry 278, 3466-3473, doi:10.1074/jbc.M210665200 (2003).
10，Shibata-Koyama, M. et al. Nonfucosylated rituximab potentiates human neutrophil phagocytosis through its high binding for FcgammaRIIIb and MHC class II expression on the phagocytotic neutrophils. Experimental hematology 37, 309-321, doi:10.1016/j.exphem.2008.11.006 (2009).
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13，Beck, A. & Reichert, J. M. Marketing approval of mogamulizumab: a triumph for glyco-engineering. mAbs 4, 419-425, doi:10.4161/mabs.20996 (2012).
14，Satoh, M., Iida, S. & Shitara, K. Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Expert opinion on biological therapy 6, 1161-1173, doi:10.1517/14712598.6.11.1161 (2006).